Route 66 speelde een belangrijke rol in de Amerikaanse cultuur van de 20e eeuw.
In de jaren dertig werd de weg gebruikt door mensen die naar Californië reisden, om de Dust Bowl, grote stofstormen op de vlakten van het midden van de Verenigde Staten, te ontvluchten.
De schrijver John Steinbeck beschrijft in zijn roman The Grapes of Wrath (De druiven der Gramschap) de lotgevallen van een arme familie die over deze weg de Dust Bowl ontvlucht.
Na de Tweede Wereldoorlog gebruikten vele nieuwe autobezitters de weg om van de ene kant van het land naar de andere te rijden.
De weg is een nostalgisch symbool voor de rol van de auto in de Amerikaanse samenleving in de periode van de jaren dertig tot zeventig van de vorige eeuw.
In 1946 schreef de jazzcomponist en pianist Bobby Troup zijn meest bekende nummer (Get Your Kicks On) Route 66, nadat hij zelf de highway had gebruikt om naar Californië te reizen.
Hij gaf het aan Nat King Cole die het tot een van de grootste hits van zijn carrière maakte.
Het werd later een hit voor Chuck Berry, en is daarna door vele andere artiesten uitgevoerd, zoals de Rolling Stones en Depeche Mode.
